蛋白质芯片技术在蛋白质组学中的应用

 【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030（2004）01-34-03

随着人类基因组计划的基本完成，以功能基因组学和蛋白质组学为主要研究内容的后基因组时代来临。由于同一基因组在不同细胞，不同组织中的表达情况各不相同，即使是同一细胞在不同的发育阶段，不同的生理条件，甚至不同的环境影响下，其蛋白质的存在状况也不尽相同。基因只是遗传物质的载体，蛋白质才是生理功能的执行者。基因转录水平的研究只能在一定程度上反映基因表达产物的变化，而真正发挥功能的蛋白质要经过转录后加工，翻译调控以及翻译后加工等许多步骤和调控才能形成 ^［1］ 。因此对基因组的研究有时并不能完全反映机体功能的变化，为了减少这种相对“误差”，迫切需要一种快捷，有效的蛋白质分析技术。

蛋白质芯片是继基因芯片之后发展起来的，以其高通量、微型化、集成化等特点，作为检测蛋白质存在和变化的高效工具，为蛋白质组学的研究提供了新的有力工具。

1 蛋白质芯片技术的概况

蛋白质芯片是指以生物分子作为配基，将其固定在固相载体的表面，形成的蛋白质微阵列（protein microarray）。根据其固定生物分子的不同，可以分为受体配体检测芯片，抗原芯片，抗体芯片等。根据芯片载体的不同，分为普通玻璃载玻片，多孔凝胶覆盖芯片和微孔芯片3种主要形式。目前应用最普遍的是玻璃片，另外PVDF膜，聚丙烯酰氨凝胶，硝化纤维素膜，聚苯乙烯微珠，磁性微珠等也有报道。近几年一种液相芯片逐渐受到人们的重视。该芯片由100种不同颜色的微球组成，每种颜色的微球可以携带一种生物探针。探针通过羧基结合到微球表面，通过鉴定微球颜色来确定反应类型，通过靶物质上的报告分子作定量分析。具有灵活性好、通量大的优点，可以对同一个样品中的多个不同的分子同时进行检测，现已被用在与各种抗原抗体反应相关的检测中。

2 蛋白质芯片技术的原理

蛋白质芯片技术主要包括四个基本要点:芯片阵列的构建，样品的制备，芯片生化反应，信号检测及分析。首先将蛋白按设计的阵列方式点印在介质上，样品蛋白质与芯片反应，然后用经过标记的（可以是酶、荧光、同位素、生物素等）蛋白质与芯片-蛋白质复合物结合，通过激光共聚焦显微镜和CCD照相机对标记信号进行扫描分析，联合应用双向凝胶电泳，表面增强激光解析离子化飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）或串联质谱（MS/MS）还可以对蛋白分 子进行定量分析。

蛋白质芯片的核心技术是蛋白芯片的制备和反应信号的检测分析。由于蛋白质分子的活性依赖于不同的折叠方式，因此对芯片的表面修饰至关重要，要保证被点在芯片上的蛋白质不失活而又能牢固的固定在芯片上。对最普遍应用的玻璃片而言，用于制备蛋白质芯片的方法主要有戊二醛修饰法、聚赖氨酸修饰法、巯基修饰法和多糖修饰法等。

随着微电子技术和微加工技术的不断发展，蛋白质芯片技术以其高通量，微型化和自动化等特点，逐渐应用到疾病诊断，药物筛选，蛋白质组研究，环境保护等诸多领域。

3 蛋白质芯片技术在蛋白质组学中的应用

3.1 疾病的蛋白质组研究 通过比较正常与病理条件下细胞或组织中蛋白质在表达量上的差异，可以发现与病理改变有关的蛋白质和疾病特异性蛋白。这些蛋白质可以作为疾病诊断的生物标志物，还可以认识发病机制，为早期诊断治疗和预防提供强有力的线索，同时还可作为对疾病进程进行监测与控制的有效手段。

3.1.1 对肿瘤特异性生物标志物的检测 尿细胞学检查多年来被认为是膀胱移行细胞癌（TCC）无创性检查的金标准，对全尿路上皮的活组织检查有一定优势，但对低分化肿瘤有较高的误/漏检率，作为膀胱镜检的辅助检查受到一定应用限制，Antonia Vlahou等 ^［2］ ，运用蛋白质芯片技术对TCC病人和其他泌尿生殖器官感染病人及健康志愿者的尿样（n=94）作了比较，从中发现了5个潜在的新型移行细胞癌的生物标志分子和7种蛋白族。单个标记物对TCC的检出率为43%～70%，联合标记分子的检出率为87%，尤其对低分化TCC的检出灵敏性为78%，而膀胱冲洗细胞学的检出灵敏度仅为33%。因而蛋白质芯片技术可以代替传统的尿细胞学检查，作为膀胱镜检的无创性辅助检查手段。

临床中从慢性肝病（CLD）患者（AFP<500microg/L）中检测出肝细胞癌（HCC）是比较困难的。利用对血清蛋白质组图谱的分析，联合应用阴离子交换分级，飞行时间质谱和人工网络（ANN），可以对AFP升高的CLD及完全缓解的HCC病人的血清样品进行辨别 ^［3］ ，该检测的特异性为90%，灵敏度为92%。与此同时，还有人用蛋白质芯片及其它相关技术对前列腺癌 ^［4］ 、乳腺癌、卵巢癌 ^［5］ 、头颈部鳞状上皮细胞癌 ^［6］ 等多种肿瘤的特异性生物标记分子做了蛋白质组图谱鉴定，为了解肿瘤的发病机制，早期临床诊断，制定新的治疗方案及预后提供了新手段。

3.1.2 在糖尿病及心血管疾病方面的应用 蛋白质芯片具有微型化的特点，可以对微量样本进行检测。DayolB等人 ^［7］ 就用1μl血浆样本测定了高密度脂蛋白apoA-Ⅰ和apoA-Ⅱ以及糖基化产物的表达水平。他们在研究中发现，WCX2芯片适于对载脂蛋白的检测，用WCX2芯片与SELDI-MS分析，apoA-Ⅰ和Ⅱ的蛋白峰分别为28和17KD，并且不与其它峰重叠，该技术耗时短，能在大约1h内即可完成对大量临床样本的检测工作，为评估动脉粥样硬化症的载体蛋白和糖基化产物的功能及流行病学调查和治疗提供了新的方法。

3.1.3 对类风湿性关节炎生物标志分子的检测 蛋白芯片技术有利于对疾病或疾病某个时期的特殊蛋白分子的检测。联合SELDI-MS对风湿性关节炎和骨关节炎病人滑液中的蛋白图谱作比较 ^［8］ ，从中发现了几种具有重现性和可辨别性的候选生物标志，其中一个为10850Da的蛋白峰，随后用大小排阻自旋柱和凝胶电泳纯化，通过做肽图和后源衰变（PSD）分析，测定为骨髓相关性蛋白8，后被酶免疫测定证实、血清和滑液中的骨髓相关性蛋白8表达水平与幼年类风湿关节炎的活性相关，因此该蛋白的测定有利于同骨关节炎的临床鉴别，同时还可对病情的进展进行跟踪调查。

3.1.4 对人类细胞因子和趋化因子的测定和定量分析 水凝胶包被的载玻片属于多孔凝胶覆盖玻片，它可以提供一种与游离溶液相似的三维亲水环境，适合生物分子的相互作用。用该芯片可以促进荧光法多重细胞因子的测定。Wang CC等 ^［9］ 将43个细胞因子和趋化因子的单克隆抗体点在芯片上，与条件性培养液，细胞裂解液和人血浆共孵，使其被阵列上的单抗捕获，然后用结合德克萨斯红的链（霉）亲和素测定，用聚焦显微镜扫描，Packard QuantArray软件定量分析。他们已经对乳癌细胞的细胞因子和人宫颈癌相关趋化因子的表达水平作了鉴定。

3.2 病原微生物的蛋白质组研究 病原微生物蛋白质组研究对于阐明感染性疾病的发病机制，实现有效的预防，早期诊断和治疗，制备新的药物等方面有着重要意义 ^［10］ ，目前主要集中在以下几个方面:①确定病原体的毒力;②寻找新的诊断标记物;③阐明药物抗菌作用的机制和致病菌发生耐药性的机理。

Grow AE等 ^［11］ 就利用新型的生物芯片对病原体和毒素进行了无标记检测。microSERS即表面增强拉曼散射显微技术，它可以对无标记的信号进行转换。他们用该技术研究了革兰阳性李斯特菌，革兰阴性军团菌，芽孢杆菌和隐孢子虫卵，它们能从生物体中以亚种/菌株水平经SERS指纹图谱鉴定出来。同时SERS指纹图谱还可以反映细菌细胞的生理状态。当致病的李斯特菌和军团菌在已知影响其毒力的条件下被捕捉，它们的SERS图谱有明显变化。同样，无法生存微生物（经加热或紫外线照射）的SERS图谱与对应可生存者有明显不同。而且microSERS还能灵敏地，高特异性地检测其毒素。他们正计划研制一种超光谱图像拉曼显微技术，那时就可以在一张芯片上快速完成多个病原菌和毒素的检测。

螺旋杆菌属与许多胃肠道疾病有关。人们对幽门螺旋杆菌了解的比较透彻，对肠肝螺旋菌的蛋白质特性却了解不多。Hynes ^［12］ 运用双向凝胶电泳，蛋白质芯片和SELDI-TOP-MS技术对4种螺旋菌的蛋白图谱进行比较，同时发现经传代培养的菌株与新鲜临床分离物中的螺旋杆菌蛋白 图谱有明显不同。

3.3 在药物开发中的应用 在病理状态下表达异常或特异性表达的蛋白质，以及细胞信号传递通路中的关键性蛋白质，都可能成为药物设计的靶分子。对它们的研究还有利于了解致病机制，为新药筛选更合理的药物靶点 ^［13］ 。用芯片做大规模筛选研究，对已知药物治疗前后病理组织的蛋白质组进行比较分析可以为新药省掉大量的动物试验，缩短药物筛选所用时间，减少后继工作的盲目性。蛋白质芯片技术可以通过对个体蛋白质组的分析，筛选出病人最适用的药物靶点，为实现个体化医疗提供新思路 ^［14］ 。

3.4 毒理学分析 通过发生损伤的组织器官与正常组织器官之间的蛋白质组比较，有助于阐明药物毒副作用的发生机制。He QY等人 ^［15］ 联合应用SELDT-TOF和Cu-蛋白芯片，WCX-蛋白芯片对微量砷诱导的细胞转化作了详细研究。B（a）P处理的，B（a）P和砷共同处理的，对照细胞提取液中的蛋白图谱明显不同。有趣的是，SAX2蛋白芯片不仅检测出了对照组细胞中优先表达的蛋白峰，而且还测到只用B（a）P处理的肺上皮细胞中过量表达的数种蛋白峰。对这些蛋白质的鉴定可以促进了解砷诱导致癌作用的机制。对已知药物的毒力学蛋白质组分析，可以鉴定组织损伤的特异性标志物，为临床前安全评价提供指标，减少临床实验风险。

4 存在问题及应用展望

蛋白质芯片技术的出现为实现对蛋白质的动态分析，识别和检测疾病特异性标志分子，研究疾病的发病机制，观察生物分子间的相互作用等提供了可能，有助于提供许多传统技术难以得到的信息。

作为一种多学科高度交叉的领域，蛋白质芯片技术还有许多问题有待解决:①基片的制备。要保持所有蛋白质在芯片上的正确折叠并结合牢固，能方便存放，还需要对基片的化学修饰方法进行更深入的探索。②样品的制备。生物样品（尤其在临床检测中）大多是各种生物组分的混合物，成份复杂，直接与芯片反应，难免会发生干扰，如何避免交叉作用还有待解决。而且对样品荧光标记时，如被标记的荧光分子过多，其与芯片蛋白的结合力受到影响，如过少则灵敏性差 ^［16］ ，因此在荧光标记物与标记方法的选择上还有待提高。③增加对信号检测的灵敏性和定量分析，并实现完全自动化。

韩国的KimTE等 ^［17］ 在对血清过敏原特异性IgE的定量检测分析中，运用了滚环放大原理，即先用生理素标记的抗人IgE与蛋白芯片-特异性IgE复合物孵育，Buffer冲洗，随后与Cy3-链霉亲和素孵育，增加了荧光强度，使对血清特异性IgE的检测灵敏度达到1IU/ml。

总之，芯片技术是一个需要微电子、微机械、化学、物理技术、计算机技术等多学科密切配合的综合性产业，相信随着蛋白质芯片技术的日益完善，必将会以其高通量，微型化，快速准确，大规模平行检测等优点在蛋白质组学研究以及临床检验，新药开发，农业和环境保护等诸多领域发挥越来越大的作用。

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16 谢文章，王东，杜宏武，等.蛋白质微阵列检测抗原-抗体相互作用.生物化学与生物物理进展，2002，29（2）:311-314.

17 KimTE，Park SW，Cho SY.Quantitative measurement of serum allergen-specific IgE on proteinchip.ExpMlol Med，2002，34（2）:152-158.

 作者单位:250062山东省医药生物技术研究中心

（收稿日期:2003-08-07）

（编辑罗 彬）