近年来，由于先后从人类头颈部肿瘤、肺癌、肠癌恶变的造血干细胞及紫外线照射引起的皮肤癌中分离出突变的p53基因，p53基因从而被归属为抑癌基因。与其它作用专一的癌基因比较，p53基因的抑癌机制牵涉了多方面的作用因而较复杂。p53基因抑制肿瘤生长机制的矛盾焦点，在于其作用点是着重于抑制肿瘤细胞增殖还是促进肿瘤细胞凋亡，亦或二者兼备?围绕此主题本文归纳总结了近4、5年来的研究进展状况。
1异质型肿瘤特异性突变株与p53基因双重性致癌机制
p53核蛋白与肿瘤的相关性认识始于体外细胞转化的研究。九十年代初，Oren和他的同事们观察到：不同来源的肿瘤标本中的p53基因突变存在着规律性：细胞多表现为p53基因丢失或发生突变，从而提出了p53为抑癌基因的假想。自此，百分之五十以上的人类肿瘤被报道含有突变的p53基因〔1〕
众多情况下人类肿瘤的发生系由于细胞核DNA分子受到了外界因素的破坏，细胞如果不能及时修复受损的DNA分子，继续使用突变的DNA作复制模板，则突变分子被保留并扩增从而通过生长优势筛选机制而可能发展成癌。对抑癌基因p53的早期研究着重于调查它在调节细胞生长周期中的表现。哺乳类动物细胞受射线辐射、细胞毒药物作用或污染核酸酶后，一小时左右细胞内p53蛋白质迅速上升且发生核内迁移；而正常状态下由于半衰期短的原因，细胞的p53蛋白质含量甚微。增多的p53蛋白质分子能直接调节DNA复制复合体的装配及功能〔2〕。含有野生型p53基因的细胞生长周期延长，大多数细胞停留于G1期。其间DNA复制酶Ⅲ活性增多，有活跃的DNA修复的生理活性。
Kastan观察到：部分携带变性p53蛋白质的肿瘤细胞接受γ射线照射时很快死亡，他解释了关于ataxiatelangiectaxia联合型免疫缺陷综合症的研究成果：p53基因能维持细胞核质的稳定性，基因丢失或突变后损伤了细胞DNA修复机制，畸变的细胞核使细胞对低剂量照射的辐射剂量敏感，造成大量癌变细胞死亡〔3〕。
很明显，上述由于p53基因丢失后造成癌细胞死亡有悖于p53基因抑癌基因原涵义，而且用细胞培养的方法显示大多数携带变性p53蛋白质的细胞对放射照射不敏感，因为野生型p53基因可以促进细胞凋亡。含变性p53基因细胞对辐射后所表现出的矛盾结果说明：调查p53基因的抑癌机制需从假DNA功能，抑制细胞生长、促进细胞凋亡等多重方面出发。
2p53基因诱导细胞凋亡与抑制肿瘤机制的探讨
七十年代后期，细胞凋亡与肿瘤发生的关系受到了重视。细胞生长与死亡之间的动态平衡是维持组织细胞内环境稳定的重要因素，如果失去平衡，如抑制细胞凋亡使癌突变的细胞获得生存机会，其通过生长优势筛选而最终发展成肿瘤。Yonish首例报道了细胞凋亡可能是突变的p53基因诱导慢性白血病发生的真正原因〔4〕。以逆转录病毒为载体，将突变的p53基因转染给正常造血干细胞；与含有正常p53基因的对照组相比，被转染的干细胞，凋亡的细胞数明显减少，同时伴有异常分化等细胞转化样改变。伴随着纯合子型p53基因丢失的骨肉瘤细胞，体外转染了野生型p53基因后，众多细胞出现凋亡的病理特征，细胞增殖速率也明显减慢。Vater观察到类似的实验结果，他将雌激素受体和p53的融合基因转染给Eia/Ras转化的纤维母细胞，在雌激素诱导下，转化的纤维母细胞表达大量功能正常的p53基因，而被转化细胞相继发生凋亡〔5〕。
Bordeesy实验组分析了来自加拿大国立Wilm肿瘤中心的七份Wilm瘤标本，其中六份标本中的浸润性癌变区出现了突变的p53基因，这些突变多发生于p53基因第175位核苷酸及其邻近的碱基序列。用末端核苷酸转移酶催化的切口末端点杂交技术在非浸润区可检测到大量凋亡的细胞，而肿瘤浸润区细胞凋亡罕见〔6〕。用转基因小鼠实验模型，近年来已先后证实野生型p53基因注射后能引起头颈部肿瘤、前列腺癌、子宫颈癌及恶性黑色素瘤的消退，而肿瘤的消长状况与细胞凋亡率密切相关〔7〕。
有些实验结果并不赞同野生型p53通过诱导细胞凋亡而抑制肿瘤的发生的观点。
紫外线照射引起表皮细胞聚集大量突变的p53基因，继而诱发皮肤癌的体内转基因小鼠模型清楚地表明：照射过的表皮细胞与正常小组的凋亡代谢动态趋势相一致〔8〕。当乳清蛋白启动子与变性p53的融合基因转移到小鼠乳腺组织后，催乳素作用于乳清蛋白启动子，促进大量的变性p53蛋白表达，凋亡的细胞数数目激增，二甲联苯胺诱导的乳腺癌发生率远低于对照组〔9〕。许多学者根据从凋亡细胞中能否发现变性p53蛋白质，将凋亡的肿瘤细胞划分成p53基因依赖型及非p53基因依赖型。
3抑制细胞生长/促进细胞凋亡，两条独立的平行线还是绕p53基因结形成的抑癌网?
辐射、γ射线照射及细胞毒性药物作用于细胞后，在野生型p53基因存在的前提下，细胞DNA复制减慢以利受损的DNA修复，同时损伤严重的细胞出现凋亡。近期内有关p53基因与抑制细胞生长、促进细胞凋亡这两种生理过程之间的相互关系的研究备受重视。细胞表现生长抑制或是凋亡取决于细胞受损伤程度是其中一种观点。Anthoney博士取对抗癌药物斯氏普兰啶不敏感的卵巢癌肿瘤细胞作体外培养。抗药性的卵巢癌细胞含有失活的p53基因，无DNA修复功能，不能抑制细胞生长；同时细胞凋亡率低下。药物敏感型亲代肿瘤细胞则有活跃的DNA修复活动及正常的细胞凋亡率。Anthoney认为突变的p53基因同时参与了细胞的DNA修复及凋亡的生理过程，两者相辅相成的关系促进了肿瘤形成及获得对抗癌药物的抵抗力。他在解释p53蛋白质同时与两种代谢活动相关的现象时指出：细胞DNA修复复合体在清除多核苷酸互补链结合的一些毒性基因时，有可能在DNA双链分子上遗留小片段切口，从而触发细胞发生凋亡。另一方面DNA修复机制被破坏的耐药细胞株在子代繁衍过程中为细胞凋亡率低的克隆提供了获得筛选优势生长的机会〔10〕。
与上述观点相悖的实验表明：从单纯的细胞生长周期的观点出发，p53蛋白质抑制细胞生长，为了检测并修复受损的DNA，大部分细胞停留于G1期，而此时期的细胞代射特征不可能诱导凋亡现象。Malcomson博士观察到当温度敏感型p53基因与Hras基因同时转移给大鼠成纤维细胞后，温度在37℃时p53蛋白展现突变型构型，细胞不能限制生长速率，同时细胞凋亡功能亢进。Malcomson解释：正常的细胞生长周期表现为无G1期滞留，细胞如常进入S期，而此期是触发细胞发生凋亡的特异敏感期。相反细胞生长受阻后，S期细胞比例低，细胞凋亡率也因此低下。所以当细胞生长受抑制时，本身状态不允许凋亡出现；但当细胞内环境发生变化，诸如出现大量促生长因子时，细胞面对反差巨大的互相矛盾的传递信号，可能选择凋亡的出路，也因此将生长抑制与凋亡两种代谢过程表面化地联系在一起〔11〕。
p53基因抑制肿瘤生长主要通过其抑制DNA复制或者促进细胞凋亡完成，这种强调单方面作用机制的观点颇有实验依据的支持。紫外线照射后诱发皮肤癌的小鼠模型显示：癌变的表皮细胞携带变性p53蛋白质，其有正常的细胞凋亡生理过程，但DNA修复能力与正常对照组相比明显减低，大量环丁烷两聚体形成〔8〕。用来源于同一亲代淋巴母细胞的两株遗传背景基本一致，其唯一的区别在于WTK1株的p53基因第七外显子发生单核苷酸突变，而TK1细胞株携带正常的p53基因。不同于TK1株，WYK1细胞株无生长抑制现象，但两者的细胞凋亡率相近，尽管动态曲线有延迟现象〔12〕。
纵观上述报道的有关p53介导的抑制细胞生长与促进细胞凋亡两种生理过程及关系的研究，尽管在这些实验中两种生理过程在肿瘤发生过程中偏差分离现象明显，但有必要深究这种分离是由其它实验因素不同所造成的假象，还是确如一些学者所述那样p53基因的活性只局限于一种生理过程。目前对于p53蛋白质分子结构的研究已证明：p53蛋白质分子含有不同的功能基因，当相应功能团活性受到不均衡破坏时，完整p53分子所诱导参与的生理活动将出现分离偏差现象。再者不同的细胞型别，细胞分化状态及是否共存其它癌基因表达，对p53蛋白质的生物学活性都会有直接或间接影响，使我们观察到的结果不尽客观〔13〕。
4p53双重抑癌效应中的转录调控作用及靶基因
DNA的复制与修复，细胞生长周期调控及诱发凋亡都是非常复杂的生理现象，p53基因不可能独立完成如此艰巨的工作。大多数学者倾向于支持p53蛋白质是转录因子的观点。他们认为含393个氨基酸的p53分子是富含磷酸基的核蛋白，通过诱导其质和量的改变，能调控与细胞生长或凋亡密切相关的一些靶基因转录水平。与其它真核类主要转录因子相似，p53蛋白质分子内部存在着多个独立的、但又互相联系及影响的功能基因。用诱导基因突变的实验方法证明p53基因中段的核苷酸序列是p53基因控制转录的主要功能团，能特异性地结合DNA。将检出的被其识别的靶基因中的p53反应核苷酸顺序，插入无相关基因氯霉素乙酰基转移酶启动子核苷酸片段中，野生型p53基因能诱导该转移酶活性。在此DNA结合功能团中含有锌离子的结合位点，邻近的氨基酸分子如175H及242S对外界环境敏感，肿瘤组织中p53突变多发生于此区域〔14，15〕。DNA片段截断筛选实验表明：删除p53氨基端及羧基端的核苷酸序列后，p53蛋白质呈现靶基因结合延缓现象，转基因试验中的抑制细胞转化能力比对照组下降。核磁共振扫描光谱分析显示p53分子氨基端存在着β片层结构，其决定着p53蛋白质在37℃时活性发挥状况，是保持p53蛋白质稳定性与灵活性的重要结构成份。同样p53羧基端的NMR图谱展现了交替的α螺旋及β片层空间构型。如果邻近的341－344位的氨基酸被替代后，由于氨基酸侧链长度的变化，交替的α螺旋及β片层结构不复存在，此将影响p53寡聚体分子的形成从而破坏p53的转录调控活性〔16〕。
分子量为19KD的Gadd45是最早被发现的p53信号链的下游基因之一。体内外实验皆表明p53诱导的Gadd45能明显延长单核型白血病细胞、大肠癌细胞的细胞生长周期，特异性Gadd45反意义单核苷酸链在体内能恢复正常的细胞生长周期〔17〕。
p21蛋白质由WAF－?基因(CIP1基因)编码，是早期报道的p53转录作用的靶基因。它能抑制细胞周期素依赖的蛋白激酶活性从而延长细胞周期，具有抑制肿瘤细胞生长的活性。目前对p53是否通过诱导p21活性而抑癌及相应的抑癌机制皆存在着争议，在一些妇科肿瘤及泌尿生殖系统肿瘤，诱导p53和p21蛋白质活性能抑制肿瘤生长。但多数学者认为调控p21蛋白质基因转录机制中，同时存在着p53依赖型及非依赖型两条途径〔18〕。因此在预测肿瘤病人五年生存率及采取术前的化学治疗方案时，应分别检测p53及p21表达水平从而作出较客观的临床辅助评判〔19〕。近年来，有学者对p53诱导的p21蛋白质能否促进肿瘤细胞凋亡提出质疑，在亲子鼠T淋巴瘤的细胞转化试验中，E1Dairy观察道：当细胞生长环境中含有白介素Ⅲ因子时，细胞核DNA对突发的损伤刺激表现为p53及p21蛋白质的转录水平提高，胸腺嘧啶核苷酸掺入法显示大多数细胞滞留于G1期。一旦白介素Ⅲ生长因子消失，细胞迅速凋亡。因此E1Dairy设想p21蛋白质能作用于细胞生长素并抑制其活性，使受影响细胞的有丝分裂期延长，细胞凋亡是由撤除白介素Ⅲ或其它因素引起的，p21蛋白质是单纯的前续事件的堆积反应产物〔20〕。
此外用比较分化cDNA序列分析的方法发现，当单核细胞白血病细胞转化了野生型p53基因后，细胞内磷脂酶C，锌指样蛋白质Zem－1因子mRNA含量比对照组明显增高。值得注意的是磷脂酶C及Zem1的编码基因因子皆位于第11号染色体13q位点，与Ⅰ型多发性内分泌肿瘤综合症的易感基因相毗邻，可能参与诱导后者发生。在同一实验中还发现一组p53基因活化蛋白质分子结构相似于果蝇胚胎发育的信号传递抗原，推测人类相类似的信号传递途径可能参与了p53的抑癌效应〔14〕。
近年来，相继报道了Bcl-2抑制细胞凋亡的实验结果，有学者认为Bcl-2通过与同源蛋白质分子Bax形成异二聚体内发挥生物学活性。Bcl-2分子通过抗氧化作用，能够中和机体代谢产生的自由基对DNA、类脂及代谢酶的破坏，从而避免细胞发生凋亡。用不同的乳腺癌细胞株提取液做Western免疫印迹分析发现：p53蛋白质含量与Bcl-2含量呈明显负相关。另外百分之五十九的Bcl-2阴性的非何杰金氏淋巴瘤细胞p53基因表达阳性，这些均提示p53基因能够抑制Bcl-2基因表达。在鼠T淋巴细胞瘤p53/Bcl-2基因同步转化实验中，Bcl-2表达阳性的细胞株保留了p53基因抑制细胞生长的生物学活性，但细胞凋亡率远低于Bcl-2阴性对照组。最近Bcl-2家族中的另一成员Bcl-XL亦被发现能抑制细胞凋亡，且与p53基因活性呈负相关〔21〕。
作者单位：安徽医科大学微生物教研室(合肥，230022)
参考文献
1 Oren M.p53,the ultimate tumor suppresser gene 〔J〕 .FASEB J.1992,6:3169.
2 Kuerbitz S J,Plunkett B S,Walsh W V,et al.Wild type p53 is a cell cycle checkpoint determinant following radiation 〔J〕 . Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:7491.
3 Kastan M B,Zhan Q,E1 Deiry W S,et al.A mammalian cell cycle checkpoint pathway utilizing p53 and GADD 45 is defective in ataxia telangiectaxia 〔J〕 .Cell, 1992,71:587.
4 Yonish Rouach E,Resnityky D,Lotem,et al.Wild type p53 indubces apoptosis of myeloid leukemia cells that is inhibited by interleukin-6〔J〕 .Nature,1991,352:345.
5 Vater C A,Bastle L M,Dionne CA,et al.Induction of apoptosis by activation of a p53 mouse embryo fibrobllasts 〔J〕 . Oncogene,1996,13:739.
6 Bordeesy N, Beckwith J B, Pelletier J. Clonal expansion and attenuated apoptosis in wilm s tumor associated with p53 gene mutations 〔J〕 .Cancer Res,1995,55:213.
7 Liu T J,E1 Nagger A K,Timothy J,et al.Apoptosis induction mediated by wild type p53 adenoviral gene transfer in squamous cell carcinoma of the head and neck 〔J〕 .Cancer Res,1995,55:3117.
8 Li G,Mitchcll D H,Ho VC,et al.Decreased DNA repair but normal apoptosis in ultraviolet irradiated skin of p53 transgenic mice 〔J〕 . American J.of Pathology,1996,148(4):1113.
9 Hague A,Manning A M,Hanlon KA,et al.Sodium butyrrte induces apoptosis in human colonic tumor cell lines in a p53 independent pathway implications for the possile role of dietary fibre in the prevention of large bowel cancer 〔J〕 . Int. J.Cancer,1993,55:498.
10 Anthoney DA,Mcilwrath A J,Gallagher W M,et al.Microsatellite instability apoptosis and loss of p53 function in drug resistant tumor cells 〔J〕 . Cancer Res,1996,6:1374.
11 Malcomson R D G,Oren M,Wyllie A H,et al. p53 independent death and p53 induced protection against apoptosis in fibrobasts treated with chemotherapeutic drugs 〔J〕 . British J.of Cancer,1995,72:952.
12 Xia F,Wang Y H,Tsang N M,et al.Altered p53 status correlates with differences in sensitivity to radiation induced mutation and apoptosis in two colsely related human lymphoblast lines 〔J〕 .Cancer Res,1995,55:12.
13 Midgley C A,Owens B,Briscoe C V,et al.Coupling between gamma irradiation,p53 induction and the apoptotic response depends upon cell type in vivo 〔J〕 . J. of Cell Science,1995,108:1843.
14 Amson R B,Nemani M,Roperch J P,et al.Isolation of 10 differentially expressed cDANs in p53 induced apoptosis:Activation of the vertebrate homologue of thedrosophila seven in absentia gene 〔J〕 . Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:3953.
15 Bullock A N,Henckel J,DeDecker B S,et al.Theimodynamic stability of wild type and mutant p53 core domain 〔J〕 .Proc.Natl. Acad.Sci USA 1997,94:14338.
16 Mccoy M,Starvridi E S,Waterman J L,et al.Hydrophobic side chain size is a determinant of the three dimensional structure of the p53 oligomerization domain 〔J〕 . EMBO J,1997,16(20):6230.
17 Smith M L,Chen I T,Zhan Q M,et al.Interaction of the p53 upregulate protein Gadd45 with proliferating cell nuclear antigen 〔J〕 .Science,1994,266:1376.
18 Makri D,Schuly W A,Grimm M,et al.WAF1/p21 regulates proliferation, but does not mediate p53 dependent apoptosis in urothelial carcinoma cell lines 〔J〕 .Int.J.Oncol.1998,12(3):621.
19 Ikeguchi M,Saito H,Katano K,et al.Relationship between the cong term effects of intraperitoneal chemotherapy and the express of p53 and p21 in patients witb gastric carcinoma at stage Ⅲ a and stage Ⅲ b〔J〕 .Int.Surg.1997 Apr-Jun,82(2):170.
20 E1 Dairy W S,Harper J W,O-Conner P M,et al.WAF1/CIp1 is induced in p53 mediated G1 arrest and apoptosis 〔J〕 . Cancer Res,1994,54:1169.
21 Haldar S,Negrini M,Monne M,et al.Down regulation of bal-2 by p53 in breast cancer cells 〔J〕 .Cancer Res,1994, 54:2095.
|
